动物肝脏DNA的提取与纯化

原理

生物体组织细胞中的大部分脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两类中复合物再不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在弄NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，既得白色纤维状的DNA粗制品。为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加入乙二胺四乙酸（EDTA）。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。

方法

1、DNA的提取：

a.称取新鲜动物的肝脏（如猪肝）约10g，于研钵中，在冰浴中剪碎，加2倍组织重的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液（约20ml）研磨成浆状，得匀浆液。

b.将匀浆液（除去组织碎片）于3000r/min离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀（内含DNP），沉淀中加两倍体积的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2~3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。

2、DNA的纯化：

a.取粗品DNA，加入5μl RNA酶，用玻璃棒慢慢搅拌20分钟。

b.向沉淀中加入冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，使总体积达到20ml，在缓慢搅拌的同时滴加25%的SDS溶液1.5ml，边加边搅拌，此步骤使核酸与蛋白质分离。

c.加入2mol/L NaCl溶液 5ml，使NaClzui终浓度为1mol/L，搅拌10分钟（速度要慢）。溶液变得黏稠并略带透明。

d.加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，于冰浴中搅拌20分钟，3000r/min离心10分钟。分层，上层为水相（含DNA钠盐），中层为变性的蛋白沉淀，下层为苯酚/氯仿/异戊醇混合液。

e.用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2~3次。

f.取上清液放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加乙醇时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，并能逐步缠绕与玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。

g.用2ml 80%乙醇洗涤沉淀物1次。

h.室温干燥，直到附于玻璃棒的残余液滴干净。

i.用1~2ml TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。