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如今，流式细胞分析在实验室中是越来越常见。然而，设计一个多色的分析却让人很头疼。在此，Bio-Rad的流式专家教你10个技巧，能帮助你设计出一个成功的多色流式分析实验。
1. 熟悉你的流式细胞仪
了解你所用的流式细胞仪的性能，这非常重要。大多数流式细胞仪有两个或多个激光器，有五种波长可供选择：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）。除了激光器，具体的滤光片和检测器也决定了你的配置。这些明确了可同时检测多少种颜色（新的仪器可能超过17种）。荧光微球的定期清洗和校准将让你更好地利用流式细胞仪。
2. 恰当地制备你的样品
制备方法不当或不健康的细胞可能导致结果不佳，因为细胞死亡或结块。在制备细胞时，你应当温柔地对待它们，避免剧烈的涡旋振荡。在染色时，如果实验允许，细胞应放在冰上。细胞团块会阻塞流式细胞仪，为了减少团块的形成，应避免高的细胞密度。加入DNase I或EDTA，也是个好办法。
3. 去除死细胞
死细胞可能带来假阳性的结果，因为自发荧光以及非特异的抗体结合增加。通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门不一定能排除死细胞，因此是使用活细胞/死细胞的染料。人们通常用碘化丙啶（PI）或7-AAD来鉴定死细胞，但这不适用于固定细胞。现在Bio-Rad还提供一种VivaFix™活细胞/死细胞染料，适用于活细胞或固定细胞。
4. 优化你的染色操作
抗体的非特异结合可能导致假阳性。通过添加BSA来封闭这些相互作用，可以减少这种非特异的结合。此外，许多细胞（如B细胞、NK细胞和巨噬细胞）在细胞表面有Fcg受体，可与抗体的Fc区域结合，造成非特异的染色。这些可通过添加FcR封闭试剂或使用F(ab)2片段来避免。高的抗体浓度也会增加非特异的结合。因此，抗体浓度应准确测定，以便提高信噪比。使用适当的抗体浓度是多色流式分析的关键。
5. 是否使用同型对照
你可能不想使用同型对照。但是，这样做的前提是你有了其他适当的对照。同型对照与你的抗体有着相同的亚型、相同的荧光基团，来自相同的供应商，在相同浓度下使用。它的目的是确保观察到的染色是由于特异性的抗体结合，从而排除Fcg受体的非特异结合，并排除抗体或荧光基团的非特异结合。
