金沙4066总区生物：如何有效完成CRISPR实验！

如何有效完成CRISPR实验！

生物学家们总是沉迷于对基因组修修补补，而其中一种近期红得发紫的技术就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 作为一种基因组编辑工具登台以来，关于这种技术的论文数量就大幅增加，的证明之一就是2015年两位科学家由于在CRISPR基因组编辑技术方面的重要贡献而获得“科学突破奖”，其中一位获奖者：Jennifer Doudna zui近在范德堡大学进行客座演讲，主会场和分会场都挤满了人，从中可以窥见这一技术的火热程度。

CRISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。直到近年，科学家们才开始利用这一系统在活体动物基因组中生成靶向突变，删除原有的基因或插入新基因。

这一技术发展迅速，就在去年，研究人员已经发现了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一种罕见肝脏疾病的方法，并且科学家们也发现可以通过这种方法切除人类免疫细胞中hiv病毒插入的基因，阻止HIV进入血液干细胞。其原因可能在于这种方法比其它基于核酸酶的编辑方法操作简便，研究人员跟着指南操作，进行一轮PCR就能基本完成CRISPR实验了。

但CRISPR/Cas系统也存在自身的一些缺陷，比如进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶，这对于临床应用来说是一大败笔。

我们需要更加和有效的CRISPR工具，研究人员也正在研究如何避免这类情况的发生，开发更好的预测编辑工具，或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式，以下是the scientist杂志汇总的新进展。

癌症研究的启示

研究者：康奈尔大学遗传学教授John Schimenti

项目：利用 CRISPR/Cas9 研发癌症和减数分裂小鼠模型

CRISPR/Cas9系统是通过在基因组上造成切口来完成编辑工作，这些切口可以通过两种途径修复，一种是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 过程进行粘合，这种方法有效但容易出错;另外一种方法就是加入包含目标突变的DNA人工片段，利用同源指导修复(homology-directed repair，HDR，编者译)完成。

Schimenti 说，“问题在于这两个过程是竞争完成的。前者NHEJ会由于实验小鼠出现非目标突变受到干扰，”他们希望能找到一种HDR途径新方法完成有效，且更的编辑，

为了解决这一问题，研究人员尝试针对过去的果蝇胚胎基因组编辑实验改进 HDR/NHEJ 比例，他们通过遗传手段抑制了NHEJ途径中的一个分子：DNA连接酶IV，碰巧正好有这么一个小分子抑制剂，SCR7能抑制这种酶的作用(这种小分子在之后的实验中被证明能作为癌症治疗分子)。

Schimenti研究组在小鼠胚胎中改变了一个基因的两个碱基，结果证明加入SCR7能将HDR:NHEJ比率从之前的1:10调整为1:2.5，这一研究成果公布在今年的Genetics杂志上，标题为A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。

如何操作：

只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的单细胞受精卵之后，在培养基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究组，如范德堡大学的Douglas Mortlock也在尝试进行这一实验。Schimenti实验室常会在实验中加入这种物质，因为目前看来SCR7并不会造成什么伤害，不过“这种小分子确实会影响其它基因，所以还是需要进行对比实验，”他说。

注意事项：

培养基中加入了SCR7(50 μ M)的受精卵生存率更高，但是在two-cell阶段，SCR7 会影响细胞进入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示这应该不成问题，因为在那之前就可以将其转入到雌性小鼠中了。

成本：从Xcessbio公司可以买到SCR7，价格为129 美元/2 mg(当地价格)。

人体细胞中的可诱导CRISPR

研究者：纪念斯隆凯特琳癌症中心干细胞生物学中心的发育生物学家Danwei Huangfu

研究项目：利用人类胚胎干细胞了解胰腺发育过程中特殊基因的作用和相互影响 CRISPR/Cas工具的一大挑战就是将这一系统中的元件传输到细胞内，通常这是通过电穿孔完成，但是将 CRISPR/Cas系统插入到人类干细胞中的这一过程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一个单一突变传送，需 要一个月的时间。

Huangfu的项目要求删除一个或多个基因的两个拷贝，这也就意味着多轮靶定，她需要一个效率更高的系统。

要解决这个问题，zui困难的一步是将大体积的Cas9 基因传入到细胞内，为此Huangfu研究组构建了一种已经整 合了Cas9元件的细胞系：首先他们采用了一种相似的技术TALEN，这种技术与CRISPR技术的不同之处在于，前者采用的是DNA结合位点，后者才有的是导向RNAs(An iCRISPR platform for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in human pluripotent stem cells)。

“通过TALENs，我们将 Cas9 整合到了人类干细胞上的一个非常特殊的位点，这一位点不易发生沉默效应。”

研究人员还设计了能在药物多西环素存在的条件下表达 Cas9 的细胞。这种方法被称为iCRISPR，研究人员能 利用iCRISPR在分化过程中不同时间点里打开基因组编辑。(注意不要将iCRISPR与CRISPRi弄混淆了，后者与RNAi相似，能可逆性的阻止转录)

iCRISPR技术能将CRISPR/Cas操作主要步骤缩减成一个：用导向RNA转染细胞，导向RNA要小得多，也更容易进 入细胞。“我们惊讶的发现(iCRISPR)作用非常好，”Huangfu说，利用这一技术，她的研究组在一个月的时 间里完成了12个基因的突变。

如何操作：

Huangfu研究组公布了这一技术的详细步骤(The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells)，如果已经有了一些人类干细胞基因靶向的实验经验，研究人员可以从Addgene 公 司购买质粒，自己构建iCas9 表达的细胞。如果材料齐全，那么一到两个月时间就能构建出 iCas9 细胞，再用接下来的一两个月时间完成基因组编辑细胞系。 如果不想从头制作 iCas9 细胞，那么可以SKI Stem Cell Research Facility。

注意事项：

虽然Huangfu研究组目前还未发现明显的脱靶效应，但是这一研究组采用了两种措施来避免潜在的脱靶(类似 于RNAi实验)：恢复实验(rescue experiments，生物通译)和用两个不同的 CRISPRs 靶向相同基因。

成本：Addgene质粒成本为$65(当地价格)，iCas9 细胞构建需要$600，SKI购买需要400美元。

新传送方式

研究者：哈佛大学化学与化学生物学教授David Liu

项目：在小鼠模型中寻找治疗遗传性耳聋的方法

基因组编辑蛋白需要进入靶向细胞核中完成任务，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一样，传递是一个主 要问题。

而且如果 CRISPR/Cas9 系统是作为DNA质粒传递进入的话，Cas9 核酸酶作用会增强，不仅会切断靶向基因， 而且还会影响其周围的基因，导致脱靶编辑。

为了解决这一问题，Liu等人模拟了科学家们将DNA和RNA一类的核酸传送至细胞中去的方式。这一系统依赖于 称作为阳离子脂质的正电荷分子，其能够结合负电荷核酸形成脂质体。脂质体一旦形成，其可通过至少两种方 式将内容物传递到细胞中。在某些情况下，脂质体有可能与细胞膜融合释放它的货物。此外，脂质体还可能与 核内体膜融合释放出内容物。

“我们有一个非常简单的想法，即将研究人员用来传送DNA和RNA的商业化阳离子脂质用于传送蛋白质。这次我 们没有采用超正电荷蛋白，而是利用了超负电荷蛋白，其类似于核酸处于高度的负电荷状态。利用阳离子脂质 来传送与高度负电荷分子结合的蛋白质，相比于采用正电荷蛋白质或肽来传送蛋白质其效力提高了近1000 倍，”Liu说。

zui终实验证实了利用这一新系统来传送基因组编辑蛋白质，至少与传送编码基因组编辑蛋白的DNA所观察到的 结果一样。而且传送蛋白比传送DNA的基因组编辑特异性要高得多。

传送DNA之后，在长时间内难以控制编码蛋白的表达量。DNA传送与期望的基因组编辑结果之间总是无法一致。在基因组编辑中，其任务是修复一个或两个拷贝的基因。而在基因组编辑蛋白完成这一任务后，你会想让它消 失，因为在此之后它所做的就是不希望发生并有可能是有害的事情。

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