谷胺酰胺合成酶试剂盒说明书

谷胺酰胺合成酶试剂盒说明书

谷胺酰胺合成酶（Glutamine   synthetase，GS）试剂盒说明书

测定意义    分光光度法

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨 酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储 存和运输形式。

测定原理

GS 在 ATP 和 Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─ 谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在 540nm 处有zui大吸 收峰，可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制

提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：10mL×1 瓶，-20℃保存。 试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂三：粉剂×2 瓶，-20℃保存。用时每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍

-20℃保存。

试剂四：10mL×1 瓶，4℃保存。

样本测定的准备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL

提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、 在 EP 管中加入下列试剂：

混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 30min

混匀，静置 10min 后，5000g，常温离心 10min，取上清液测定 540nm 处的吸光值 A。△A=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

GS 活力单位的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每 min  使 540nm 下吸光值变化 0.01 定义 为一个酶活力单位。

GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（Cpr×V 样）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每 min  使 540nm 下吸光值变化 0.01 定义为一个 酶活力单位。

GS（U/g  鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.8mL； V 样：加入样本体积，0.14mL；V 样总：加入提取液 体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。