明胶酶谱法检测试剂盒

仅用于科学研究,不能用于诊断
操作流程
明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子
存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，后用考马斯亮蓝将
凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
1. 样本制备。
a. 细胞上清：
（1）取6孔板中对数生长期的肿瘤细胞，用无血清培养基冲洗3次，每孔中加入1ml无血清培养基，实验分组，加入干预
因素，37°C、5%CO 恒温培养箱中培养24h。
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（2）将细胞培养上清液移入离心管中，4°C、2000rpm离心10min，取上清分装后–80°C保存备用。
（3）BCA法测定各样品蛋白浓度，根据不同浓度确定样品的上样体积，保证各样品上样的蛋白质量相同，与4×上样缓冲
液5µl混合，总体积不足20µl用三蒸水补足（可以根据制胶时孔的大小决定上样总体积）。
b. 血清 : 取适量血清直接与4×上样缓冲液等体积混匀 , 如酶活性太高造成显带不理想 , 可适当进行稀释。
2. 参照表一配制10%分离胶（含1%明胶）和5%浓缩胶，制胶，等胶干之后，加入电泳缓冲液，使其溢满上样孔。
3. 上样，4°C、100V进行SDS-PAGE 电泳，直至溴粉蓝跑至分离胶的底部。
4. 电泳结束后，切取包括72KD和92KD合适大小的凝胶放置于洗脱液中振荡洗脱4次，每次15min。
5. 漂洗液中震荡漂洗2次，每次20min。
6. 孵育液中，37°C水浴锅中孵育48h。
7. 染色液中摇床上震荡染色3h。
8. 将凝胶置于脱色液中，震荡脱色2h。
9. 脱色完成后，在蓝色背景上，可见72KD和92KD处为白色条带。