上海金沙4066总区告诉你酵母RNA的分离和鉴定

实验原理

  由于RNA的来源和种类很多，因此提取方法各异，一般有苯酚法、去污剂法、和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室zui常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中。DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA及蛋白质，提取的RNA具有生物活性。

  工业上制备RNA多选用成本低，适于大规模操作的稀碱法及浓盐酸。用发酵工业的下脚料如酵母、白地酶如青霉菌菌丝体登提取RNA，其得率常为菌种重量的3%~5%。而DNA含量仅为0.03%~0.52%，因此提取RNA多以酵母为原料。稀碱法是用氢氧化钠溶液，使细菌细胞壁变性，浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。用稀碱法使酵母细胞裂解后，用酸中和，然后除去菌体，使乙醇沉淀上清液中的RNA或将pH值调至RNA的等电点，是蛋白质沉淀出来。

  RNA是生物高分子化合物，进一步水解可生成磷酸、戊糖和碱基。各种组分可用于下述方法鉴定：

  1.磷酸于钼酸铵试剂作用能产生黄色的磷钼酸铵沉淀。

  2.核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。

  3.嘌呤碱与硝酸银产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

实验方法

  1.酵母RNA提取：

  （1）称4g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%氢氧化钠溶液，沸水浴上加热30分钟，不断搅拌。

  （2）加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性，4000r/min，离心10~15分钟。

  （3）取上清液，加入30ml 95%乙醇洗2次，每次用10ml。

  （4）用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时可用小玻棒小心搅动沉淀。

  （5）用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。

  （6）称量所得RNA样品重量，计算得率。

  2.RNA组分鉴定：

  （1）水解RNA：像锥形瓶中加入少量（0.1~0.2g）酵母RNA个10%硫酸溶液15ml，在瓶口上插一玻璃小漏斗，漏斗上盖上表面皿，然后在沸水浴中加热水解约30分钟，过滤，取滤液进行下列实验。

  （2）嘌呤碱基的检查：取试管一支，加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，再逐滴加1mol/L氨水至沉淀消失。然后加入1ml滤液，放置片刻，观察有无嘌呤碱基的银化合物沉淀产生。

  （3）磷酸的检查：取2ml滤液放入1支试管中，加入5滴硝酸银和1ml钼酸铵溶液后，在沸水中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

  （4）戊糖的检查：取一支试管，加入1ml滤液，然后加入2ml地衣酚试剂，摇匀后在沸水浴上加热10~15分钟，观察颜色的变化。  

注意事项

  1.稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。

  2.脱氧核糖及核糖均可与地衣酚反应。因此地衣酚试验不能作为RNA与DNA鉴定的依据。