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上海金沙4066总区生物代理销售“辣根过氧化物酶”,现货供应,开学7折*,欢迎。
过氧化物酶催化以下反应:
2 H2O2 →O2+2H2O
这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。过氧化物酶在生物界分布极广,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
本实验是以辣根为原料,经过水的抽提,硫酸铵和丙酮分级分离,再经锌离子纯化,透析除盐,冷冻干燥,zui后制得高纯度的辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶分子量在40,000左右,是一种含亚铁血红素的蛋白质,等电点7.2;易溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕红色,透明;也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液,而0.62饱和度以上则不溶。该酶zui适pH为7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下HRP在几周内保持稳定,加热到63℃后15分钟内稳定。
辣根过氧化物酶氧化还原电势很低,pH6.08时,E’0= -0.2070v;pH为7.71时,E’0= -0.5787v。
辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步:
*步,形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ:
*步第二步,复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ:
复合物Ⅰ+AH→复合物Ⅱ+A
第三步,复合物Ⅱ被还原,释放出酶:
第三步AH:表示还原型氢供体。
在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物(P),亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。
辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种,主要原理介绍如下:
1、Rz值,提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。
403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收,275nm的吸收是蛋白质的吸收,结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白/毫升。
2、愈创木酚法:测k4[见反应式⑶]。以愈创木酚(邻甲氧基酚,guaiacol)为氢给体,其反应如下:
四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚(E470nm = 26.6mM-1·cm-1)生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下:
e—酶浓度;
α0—氢供体起始浓度;
x0为过氧化氢的起始浓度。
如果测定的条件选择成k4α0》k1x0,可以测得k1:
所以
所以:
—测定过程中底物减少的速度。
本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。
上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单,但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法,以过氧化氢为底物,在酶作用下,连苯三酚可形成红棓酚(Purpurogallin),在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值(PZ)表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。
辣根过氧化物酶
仪器和试剂
仪器
离心机、干燥器、分光光度计。
试剂
⒈ 硫酸铵:工业纯和化学纯;
⒉ 丙酮。
⒊ 10mM pH7.0磷酸盐缓冲液:称取243.5毫克磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和857毫克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),溶于400毫升水中。
⒋ 20mM愈创木酚溶液:取0.22毫升愈创木酚加水至100毫升。
⒌ 40mM过氧化氢溶液:取0.4毫升30%过氧化氢加水至100毫升(如测k1则用10mM过氧化氢溶液)。临用前配制。
⒍ 5%乙酸钡溶液
⒎ 奈氏试剂
⒏ 0.1 mol/L硝酸银溶液
辣根过氧化物酶