实时荧光定量PCR（RT-PCR）实验代测

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实时荧光定量PCR（RT-PCR）实验代测

1.聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。Real -Time PCR，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，zui终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来，广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。

实时荧光定量PCR（RT-PCR）实验代测

2 方法

2.1 组织总RNA的提取

（1）取组织或者细胞于1mL的Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；

（2）置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；

（3）吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；

（4）吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；

（5）加入1mL75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；

（6）加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；

（7）加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。

2.2 cDNA*条链的合成

2.2.1  总RNA中DNA的消除

37℃，30min；Hold，加1μL的EDTA；65℃，10min。

2.2.2 反转录

（1）按以下体系加入：

反应程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。

2.3 Real-time PCR扩增

将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0.5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

总体积 25μL

反应程序：

95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec；

数据采用仪器自带软件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

实验结果

提供实验原始数据

cytochrome c mRNA扩增动力学曲线

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